manuel de préparation des noyaux à partir de tissu rénal de souris pour une analyse de l'accessibilité de la chromatine

nuclei preparation from mouse kidney tissue for chromatin accessibility analysis

Michael Rehman, Zemeng Wei, Stefan Somlo. Yale University, USA

context

Les reins sont deux organes en forme de haricot situés de chaque côté du corps. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie en filtrant le sang, en éliminant les déchets et en produisant de l'urine. Le sang entre dans les reins par les artères rénales et sort par les veines rénales. Chaque rein est relié à un uretère qui transporte l'urine jusqu'à la vessie.

La maladie polykystique rénale autosomique dominante (ADPKD) est un trouble héréditaire courant, le plus souvent causé par des mutations dans les gènes codant pour la polycystine-1 (PC1) ou la polycystine-2 (PC2). Elle se caractérise par la formation de nombreux kystes remplis de liquide dans les reins, entraînant des complications telles que l'hypertension, les calculs rénaux, les infections récurrentes des voies urinaires et, finalement, une insuffisance rénale. L'ADPKD affecte environ 12 millions de personnes dans le monde. Il n'existe actuellement aucun remède, et la formation de kystes ne peut pas être arrêtée.

Il a été récemment démontré que la famille des facteurs de transcription Glis joue des rôles importants dans l'ADPKD¹. Nous avons spécifiquement observé Glis3 comme un modificateur de l'ADPKD car l'inactivation double de Glis3 et Pkd1 a significativement aggravé le phénotype rénal polykystique. Cela a été réalisé en utilisant une méthode spécifique avec le Precellys Evolution qui permet l'isolement des noyaux des reins sauvages et précystiques pour la séquence ATAC de manière midi-throughput. Cette note d'application décrira la méthode de génération de noyaux adaptés pour ATAC-seq de manière midi-throughput à partir de tissu rénal de souris.

materials

• Precellys Evolution Touch (Numéro de catalogue : P002511-PEVT0-A.0)
• Homogénéisation de tissus durs CK28-R (Numéro de catalogue : P000916-LYSK0-A.0)
• Tissus rénaux de souris adultes sauvages et précystiques C57BL/6J
• Solution de préparation des noyaux : Tris HCL pH 7.5 10mM, MgCl2 3mM, NaCl 10mM, Eau

Precellys Evolution Touch

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protocol

Les reins de souris adultes des deux types, sauvage et précystique, conservés à -80°C ont été utilisés. Environ 1/4 d'un rein a été utilisé pour la préparation des noyaux. Les tissus ont d'abord été coupés sur une plaque glacée avec un scalpel propre et transférés dans des tubes CK-28-R avec des billes et maintenus sur glace.

La solution de préparation des noyaux a ensuite été ajoutée aux tubes et les tissus ont été homogénéisés à 4 500 tr/min pendant 10 secondes avec le Precellys Evolution Touch et remis sur glace.

Le mélange a ensuite été passé à travers un tamis de 40 µM suivi d'un tamis de 20 µM pour obtenir des noyaux isolés. La pureté de la préparation des noyaux a été déterminée par coloration au bleu Trypan et comptage des noyaux avec un hémocytomètre.

Le nombre approprié de noyaux (50 000 à 100 000) a été compté et traité avec le pipeline ATAC-seq.

results

Figure 1: Validation de deux échantillons de reins de souris avant de les utiliser comme contrôle de qualité pour le séquençage. A: exemple de noyaux isolés colorés au bleu Trypan par la méthode décrite. B: résultats du Bioanaliseur des deux échantillons.

Grâce au protocole précédemment décrit, une bonne coloration des noyaux a été réalisée (Figure 1.A), témoignant d'une bonne qualité d'échantillon pour l'analyse au Bioanalyzer.

Le profil du Bioanalyzer montre une bibliothèque ATAC-seq typique (Figure 1.B). Il y a un pic principal autour de 250 paires de bases, qui représente des fragments de mono-nucléosomes. Des pics plus petits apparaissent près de 400 et 600 paires de bases, indiquant des di- et tri-nucléosomes. La courbe diminue lentement jusqu'à environ 1000 paires de bases, ce qui signifie qu'il existe des fragments plus longs. Le grand pic à l'extrême droite est le marqueur de taille, ne faisant pas partie de la bibliothèque.

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conclusion

Les résultats montrent que le Precellys Evolution Touch, en plus de lyser les cellules tout en gardant les noyaux intacts, est un excellent équipement pour faciliter la préparation des noyaux de manière midi-throughput à partir de reins normaux et précystiques de souris.

C'est une avancée importante car les méthodes sont limitées pour obtenir des noyaux avec une méthodologie midi-throughput afin de réduire l'effet de lot. Cela permet aux chercheurs d'obtenir des échantillons cohérents et de haute qualité pour l'analyse moléculaire dans le domaine des maladies rénales telles que l'ADPKD.

¹Wei et al, Glis3 est un modificateur de la progression des kystes dans la maladie rénale polykystique autosomique dominante. J Am Soc Nephrol. 2025 Dec 16. doi: 10.1681/ASN.0000000980.

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