Extraction reproductible d'ARN intact et de noyaux de reins murins kystiques (-80 °C) pour RNA-Seq et ATAC-Seq

Dans les études sur rein murin normal et kystique (ex. modèles ADPKD), extraire de façon reproductible un ARN total intègre et des noyaux intacts depuis des tissus stockés à -80 °C est un point critique : le broyage peut générer des effets de lot et dégrader les métriques qualité avant RNA-Seq/ATAC-Seq. Un flux de travail midi-débit basé sur l'homogénéisateur Precellys Evolution Touch de Bertin Technologies permet de standardiser l'homogénéisation et de stabiliser la qualité des échantillons.

Contexte d'utilisation (cas d'application)

Ce cas d'utilisation décrit un scénario typique rencontré en laboratoire de recherche ou de plateforme d'analyses omiques travaillant sur des tissus rénaux murins (sauvages, pré-kystiques ou kystiques), avec des échantillons congelés et stockés à -80 °C.

1) Problématique : limiter la variabilité lors de l'extraction d'ARN et de noyaux à partir de rein murin congelé

Type de laboratoire concerné

• Laboratoires académiques ou industriels en physiopathologie rénale (ADPKD, progression pré-kystique, comparaison de groupes expérimentaux).
• Plateformes de transcriptomique et d'épigénomique nécessitant des critères qualité constants avant préparation de librairies.

Difficultés techniques rencontrées

• Obtention d'un ARN total de haute intégrité à partir de tissus stockés à -80 °C : le broyage et l'échauffement local peuvent dégrader l'ARN.
• Récupération de noyaux intacts pour ATAC-Seq : un cisaillement excessif ou un protocole trop agressif altère l'intégrité des noyaux et la qualité des librairies.
• Variabilité inter-lots (batch effects) lors des étapes amont (broyage/homogénéisation), particulièrement marquée sur des reins présentant des modifications tissulaires (pré-kystiques/kystiques).

Impacts sur les analyses aval (-Seq)

• Qualité d'ARN hétérogène (ex. profils ribosomiques moins nets, variabilité des métriques type RQN) rendant les comparaisons entre séries moins robustes.
• Suspensions de noyaux variables (débris, noyaux endommagés, comptage instable) pouvant impacter l'accessibilité chromatinienne mesurée et la reproductibilité ATAC-Seq.
• Risque de répétitions d'expériences et de perte de temps de séquençage si les critères qualité ne sont pas atteints avant envoi.

2) Solution : homogénéisation standardisée midi-débit avec Precellys Evolution Touch pour sécuriser la préparation amont

La réponse apportée repose sur un flux de travail midi-débit utilisant l'homogénéisateur Precellys Evolution Touch, afin de traiter en parallèle des reins murins (sauvages et pré-kystiques) et de réduire la variabilité introduite par l'étape d'homogénéisation.

A. Extraction d'ARN total : paramètres d'homogénéisation et chaîne d'extraction

• Matrice : tissus rénaux conservés à -80 °C.
• Lyse/homogénéisation : 800 µl de Trizol.
• Conditions instrument : 6800 rpm pendant 30 s, 2 cycles, avec 30 s sur bain de glace entre les cycles.
• Séparation de phase : ajout de 200 µl de chloroforme.
• Purification : après ajout d'un volume égal d'éthanol 100 %, purification sur colonne (RNeasy Mini Kit).

Contrôle qualité requis avant RNA-Seq

• Contrôle d'intégrité sur Agilent 2200 TapeStation : bandes 28S/18S robustes.
• Critère de reproductibilité : valeurs RQN élevées et cohérentes (échelle 1 à 10) entre lots.
• Entrée RNA-Seq : utilisation directe avec 2 µg d'ARN pour synthèse de cDNA.

B. Préparation de noyaux pour ATAC-Seq : homogénéisation douce et filtration

• Quantité de tissu : environ 1/4 de rein.
• Tampon noyaux : Tris-HCl 10 mM pH 7,5 ; MgCl2 3 mM ; NaCl 10 mM.
• Conditions instrument : 4500 rpm pendant 10 s (objectif : limiter le cisaillement, préserver l'intégrité nucléaire).
• Clarification : filtration successive 40 µm puis 20 µm pour obtenir une suspension exploitable.
• Contrôle : Trypan blue + comptage à l'hémocytomètre.
• Entrée ATAC-Seq : 50 000 à 100 000 noyaux engagés dans le pipeline.

Contrôle qualité des librairies ATAC-Seq

• Profil attendu observé : pic principal vers 250 bp et pics secondaires vers 400 et 600 bp, compatible avec une mesure d'accessibilité chromatinienne et le séquençage.

Pourquoi le Precellys Evolution Touch répond à ce besoin

• Standardisation du broyage/homogénéisation : des paramètres reproductibles (vitesse, durée, cycles, pauses sur glace) contribuent à réduire les effets de lot.
• Adapté aux workflows -Seq : possibilité de définir des cycles courts et répétables, compatibles avec la protection des analytes thermosensibles (ARN) et l'homogénéisation contrôlée pour extraction de noyaux.
• Approche midi-débit : traitement parallèle d'échantillons pour sécuriser les comparaisons multi-séries (animaux/conditions).

Produits et acteur mobilisés

• Homogénéisateur : Precellys Evolution Touch
• Réalisation proposée par : Bertin Technologies